Thành lập mô hình động vật viêm khớp dạng thấp do chất bổ trợ của Freund gây ra

Viêm khớp dạng thấp (RA) là một bệnh viêm khớp mãn tính đặc trưng bởi tình trạng viêm màng hoạt dịch dai dẳng, viêm toàn thân và xói mòn xương và sụn, cuối cùng có thể dẫn đến cứng khớp và biến dạng khớp. Các mô hình động vật RA được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu về bệnh sinh và phương pháp điều trị. Nhiều mô hình động vật khác nhau đã được thiết lập để nghiên cứu về nguyên nhân, bệnh sinh, các yếu tố ảnh hưởng của RA và nghiên cứu các mục tiêu điều trị mới và đánh giá các liệu pháp mới.

Các mô hình động vật RA có thể được chia thành hai loại: mô hình cảm ứng và mô hình chuyển gen. Các mô hình cảm ứng phổ biến bao gồm Viêm khớp do Collagen (CIA) và Viêm khớp do Adjuvant (AA), trong khi các mô hình chuột chuyển gen bao gồm các mô hình chuyển gen TNF-α của người, v.v.

Chất bổ trợ Freund, được Jules Freund phát minh vào những năm 1940, là nhũ tương kháng nguyên dầu trong nước được tạo ra bằng cách trộn dung dịch nước kháng nguyên với tác nhân dầu và thêm chất nhũ hóa. Đây là chất bổ trợ được sử dụng phổ biến nhất trong các thí nghiệm trên động vật.

Chất bổ trợ Freund được chia thành Chất bổ trợ Freund hoàn chỉnh (CFA) có chứa Mycobacterium tuberculosis và Chất bổ trợ Freund không hoàn chỉnh (IFA) không có Mycobacterium tuberculosis. Chúng chủ yếu được sử dụng để gây ra các mô hình Viêm khớp do Collagen (CIA) và Viêm khớp do Chất bổ trợ (AA) ở chuột.

Hình 1. Viêm khớp dạng thấp ở người

Hình 2. Viêm khớp dạng thấp ở chuột

1.1 Mô hình chuột

Mô hình CIA là một trong những mô hình chuột RA được sử dụng rộng rãi nhất. Việc tiêm chủng cho động vật bằng collagen loại II dị loại có thể gây ra phản ứng tự miễn dịch chống lại collagen loại II trong sụn khớp, với các biểu hiện lâm sàng của viêm khớp ngoại biên đa khớp.

Phương pháp xây dựng mô hình: Collagen loại II ở bò (CII) được hòa tan trong axit axetic băng ở nhiệt độ 4°C qua đêm. Sau đó, Mycobacterium tuberculosis (BCG) đã bị tiêu diệt bằng nhiệt được đặt trong parafin lỏng để chuẩn bị tá dược Freund hoàn chỉnh (CFA). Hai chất này được trộn và nhũ hóa để chuẩn bị nhũ tương collagen loại II. Nhũ tương này được tiêm dưới da vào gốc đuôi chuột với nồng độ 0,1-0,2 mL để gây viêm. Vào ngày thứ 21 sau lần tiêm chủng ban đầu, một mũi tiêm nhắc lại 0,1-0,2 mL nhũ tương collagen loại II được tiêm vào màng bụng. Sau lần tiêm chủng đầu tiên, chuột sẽ có phản ứng viêm tại chỗ và lành trong vòng khoảng một tuần; sau khi tiêm tá dược, chuột sẽ bị sưng khớp bắt đầu từ ngày thứ 24, tiến triển từ chân sau đến chân trước và sau đó đến đuôi.

1.2 Mô hình chuột

Phương pháp xây dựng mô hình: Collagen loại II của bò (CII) được trộn với tá dược Freund không đầy đủ (IFA) theo thể tích bằng nhau và nhũ hóa. Vào ngày đầu tiên, chuột được tiêm nội bì tại nhiều vị trí và một tuần sau, chúng được tiêm tăng cường nội phúc mạc. Mô hình được thu thập trong vòng 3-7 ngày sau lần tiêm chủng thứ hai. Bảy ngày sau khi nhạy cảm, khớp mắt cá chân sẽ hơi sưng và đỏ, và các triệu chứng sẽ trở nên tồi tệ hơn sau 3 tuần, có thể loét da; sau 5-6 tuần, các thay đổi bệnh lý trở nên tồi tệ hơn, với sụn khớp và xương dưới sụn bị xói mòn và phá hủy bởi pannus.

Mô hình AA là mô hình RA trên chuột được sử dụng rộng rãi nhất, với hai loại: Tá dược Freund không đầy đủ (IFA) và Tá dược Freund hoàn chỉnh (CFA).

Phương pháp xây dựng mô hình: Tiêm nội bì cho chuột để gây viêm.Mô hình thường biểu hiện các triệu chứng viêm liên tục 10-20 ngày sau khi khởi phát, đạt đỉnh vào khoảng 20 ngày. Viêm chủ yếu ở khớp mắt cá chân, có thể ảnh hưởng đến gan bàn chân và toàn bộ bàn chân. Các triệu chứng sưng khớp tương tự như các triệu chứng của bệnh nhân RA lâm sàng, nhưng có thể xảy ra hiện tượng rối loạn chức năng miễn dịch.

• Collagen loại II của bò (CII) được hòa tan trong dung dịch axit axetic băng ở nồng độ 2 mg/mL và để qua đêm ở nhiệt độ 4°C.
• Chất bổ trợ Freund không đầy đủ được bổ sung Mycobacterium tuberculosis đã bị tiêu diệt bằng nhiệt với nồng độ 2-5 mg/mL. Nồng độ Mycobacterium tuberculosis trong chất bổ trợ Freund hoàn chỉnh 60718ES do Yisheng Biology cung cấp là dưới 10 mg/mL.
• Dung dịch axit axetic collagen loại II ở bò được trộn với tá dược Freund hoàn chỉnh theo thể tích bằng nhau và nhũ hóa.
• Mỗi con chuột thí nghiệm được tiêm dưới da 4-6 lần vào lưng, tổng lượng thuốc là 0,1-0,2 mL.
• Ba tuần sau, chất bổ trợ Freund không đầy đủ được trộn với dung dịch axit axetic collagen loại II ở bò theo thể tích bằng nhau và nhũ hóa, sau đó tiêm dưới da 3-5 lần vào gốc đuôi mỗi con chuột, tổng cộng 0,1-0,2 mL.

• Chuẩn bị các thuốc thử có liên quan, lưu ý bối cảnh của nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng.
• Quan sát và ghi chép: Nhìn chung, hơn 80% chuột biểu hiện triệu chứng viêm khớp sau 7-12 ngày tiêm chủng lần thứ hai. Các triệu chứng lâm sàng được phân loại dựa trên tình trạng đỏ và hoạt động của khớp chuột, và các quan sát được ghi lại trước khi thử nghiệm và vào ngày thứ 3, ngày thứ 5, ngày thứ 7 và ngày thứ 12 sau khi thử nghiệm, với các tiêu chí phân loại như sau:

Bảng 1 Tiêu chí chấm điểm

Scốt lõi

Symptom

0

Hoạt động bình thường, không có dấu hiệu ban đỏ và sưng tấy.

1

Hoạt động bình thường, chỉ có da bị đỏ và không bị sưng đáng kể.

2

Hoạt động bị ảnh hưởng nhẹ, móng vuốt, đệm bàn chân hoặc khớp gối bị đỏ.

3

Hoạt động bị ảnh hưởng, ngón chân và khớp hơi biến dạng và sưng.

4

Vận động bị cản trở, ngón chân và khớp bị đỏ và sưng nghiêm trọng, cứng hoặc biến dạng.

• Đo chuột: Sử dụng máy đo thể tích chân chuột để đo thể tích khớp chân sau của chuột trước và sau khi thí nghiệm. Đo thể tích khoảng 5 mm dưới khớp gối của chân sau của mỗi con chuột ba lần, ghi lại giá trị trung bình và thể tích tỷ lệ thuận với mức độ đỏ và sưng khớp. Phát hiện được thực hiện ba ngày một lần.
• Kiểm tra bệnh lý: Lấy chuột từ nhóm thực nghiệm và nhóm đối chứng, lột da, cố định bằng formaldehyde 4% trong hơn 48 giờ, khử canxi bằng axit nitric 5% trong 2 giờ, nhúng trong xylen và nhúng trong parafin. Cắt lát 6 mm, nhuộm HE và quan sát bằng kính hiển vi quang học thông thường để thiết lập tiêu chuẩn chấm điểm cho chẩn đoán bệnh lý.

5 Hình ảnh trường hợp thử nghiệm (trích từ tài liệu)